ZZ/ZW型脊椎動物初、両生類初の性(♀)決定遺伝子DM-W
伊藤　道彦（北里大学　理学部）

はじめに

我々は、この2年間の本特定領域研究（公募研究）におきまして、ZZ/ZW型脊椎動物で初、両生類で初の性(♀)決定遺伝子の発見を成果として報告させていただきました^１）。
　脊椎動物では、XX/XY型性決定様式を持つ哺乳類（真獣類）および魚類メダカで、いずれもY染色体上に♂（精巣）を決定する性決定遺伝子として、SRYおよびDMYが同定されていましたが、ZZ/ZW型の種では、性決定遺伝子は同定されていませんでした。我々の研究グループは、本特定領域に参加する以前、アフリカツメガエルで♀特異的遺伝子DM-Wを発見し、構造・発現解析から、DM-Wが性（♀）決定遺伝子であるという作業仮説を立て、検証を進めておりました。本特定領域の参加の場をいただき、精力的に機能解析を行うことが可能となり、DM-Wが性（♀）決定遺伝子であるという結論に達する知見を得る事ができました。本特定領域の賜物と深く感謝致している次第です。

図1：アフリカツメガエル（Xenopus laevis) とその性決定様式

ZZ/ZW型性決定様式を持つアフリカツメガエルの性決定機構の解明を目指して

アフリカツメガエル（図1）は、古くから発生学の実験動物として汎用されている無尾両生類で、遺伝的な交配実験から♀ヘテロ（ZZ/ZW）型の性決定様式を持つと考えられていました。しかし、通常の染色法では雌雄の染色体に形態的な差異が認められず、性の決定に直接関わる分子的研究はほとんど皆無の状況でした。私は、両生類で性決定遺伝子が未同定であった事に加え、脊椎動物ではZZ/ZW型動物種の性決定遺伝子が知られていない事から、アフリカツメガエルを用い、性決定遺伝子候補の探索に着手しました。

アフリカツメガエル♀ゲノム特異的DM-W遺伝子の発見！W染色体の発見！

性決定、性分化に関わる可能性が高い遺伝子をスクリーニングあるいは幾つかピックアップし、性染色体に存在しないか検討を重ねた結果、精巣形成関与が示唆されるDMRT1遺伝子^２）のパラログと考えられる♀ゲノム特異的遺伝子DM-Wの単に成功しました（図2）。DM-Wは、魚類メダカの性（♂）決定遺伝子DMYと同じファミリーに属します。この♀ゲノム特異的遺伝子DM-Wを用い、本特定領域の松田洋一教授研究グループにFISH解析を行っていただき、3番染色体が♀ゲノム特異的なW性染色体であることが判明しました^１）。

図2：DM-W と DMRT1タンパク質の構造模式図

RT-PCRおよびin situ hybridization解析から、DM-Wは性決定期のZW未分化生殖巣で特異的に発現する事がわかりました^１）。更に、�@DM-Wは、DMRT1とDNA結合領域（DMドメイン）で極めて相同性が高いが、C末端領域は有意な相同性はない、�A以前の筆者らの研究から、DMRT1のC末端領域は転写活性化能を持つ^２）（図2参照）、という事から、両タンパク質は同様のDNA結合特性を持ちながら、標的遺伝子に対する機能が違う可能性が考えられました。これらの知見とDMRT1の精巣形成最上位遺伝子である可能性を考慮し、我々は、♀ゲノム特異的遺伝子DM-Wが卵巣形成を導く性（♀）決定遺伝子である！という作業仮説を立て、その検証のために、以下の2つのタイプの遺伝子導入個体を作製し解析を行いました。

（1）DM-W発現トランスジェニック個体の解析：DM-Wは、ZZ個体に卵巣構造を誘導する！

図3：DM-W発現トランスジェニック幼生（stage 56) の生殖巣 OC, 卵巣腔；PO, 第一次卵母細胞；GC, 生殖細胞；Sg, 精原細胞；Og, 卵細胞

（2）DM-W発現ノックダウントランスジェニック個体の解析：DM-W発現抑制は、ZW個体に精巣を誘導する！

（1）とは逆に、W染色体上にDM-Wを持つZW個体の生殖巣でDM-W発現を抑制させるノックダウンベクターを導入した個体を作製し、（1）と同様のステージ56のZW幼生の生殖巣を調べたところ、いくつかのトランスジェニック個体で卵精巣が観察されました（未発表データ）。更に重要な事に、2匹のトランスジェニックZW成体に精巣が観察され、1匹には精子まで形成されていました（投稿準備中）。この事は、DM-Wたった1つの遺伝子の発現抑制が、本来卵巣になる運命だった生殖巣を精巣へと性転換させたと考える事ができます。

これらの結果から、我々は、DM-Wは、アフリカツメガエルの性決定遺伝子であると結論しました。DM-Wは、両生類で初めて発見された性決定遺伝子であると共に、ZZ/ZW型の性決定様式を持つ脊椎動物で初めて発見された♀誘導型の性決定遺伝子であると考えられます。

アフリカツメガエルのZZ/ZW型性決定モデルの提唱 〜DM-Wはアンチ精巣型の性（♀）決定遺伝子！？〜

さて、ZW個体ではDM-Wが性決定遺伝子としてどのように卵巣形成を誘導し、一方、DM-WのないZZ個体ではどのように精巣形成が誘導されるのでしょうか？前述したように、DM-Wは、DMRT1とDMドメインというDNA結合領域で相同性が非常に高い事、また2つのタンパク質は性決定期の生殖巣で同じ細胞で発現している事（未発表）から、両者の標的遺伝子は同じ可能性が高いと考えられました。一方、両者のC末端領域は、有意な相同性は無く、標的遺伝子への転写調節において機能差異が示唆されますので、我々は、図4に示すような、全く新しいタイプ性決定の分子モデルを考案しました。このモデルでは、ZZ（遺伝的♂）個体では、DMRT1（王様役）が精巣形成最上位遺伝子産物として精巣形成を誘導し、一方、ZW（遺伝的♀）個体では、DM-W（女王様役）が、DMRT1タンパク質の機能を抑制し、結果的に卵巣形成を導く、というモデルです。すなわち、このモデルでは、DM-Wはアンチ精巣形成型の性（♀）決定遺伝子であると言い換える事ができます。このモデルの検証に関しては、in vitroで、同じDNA配列にDMRT1とDM-Wが結合する事、DM-WがDMRT1の転写活性化能を抑制する事を見いだしています（未発表）が、今後、個体レベルでの検証を行う必要があります。

アフリカツメガエルの卵巣形成遺伝子発現ヒエラルキーの解析

性決定後の初期卵巣形成に関しては、雌性ホルモン（エストロゲン）によって性転換が観察される事から、エストロゲン合成酵素であるアロマターゼ遺伝子Cyp19および、その発現制御に関わる事がいくつかの動物種で報告されている転写因子Foxl2が重要な機能を担っている事が考えられました。そこで、Cyp19 、Foxl2の発現をRT-PCRで調べた所、性決定期と初期性分化期の生殖巣において、ZW特異的発現が認められ、両遺伝子が初期卵巣形成に重要な機能を持つ可能性が示唆されました。更に、DM-Wを頂点とする卵巣形成遺伝子発現カスケードにおいて、Cyp19 、Foxl2がDM-Wの下流に位置するか確認するために、DM-W発現ベクターを導入した個体を作製し、性決定期に解析しました。発現解析の結果、DM-Wのエクトピックな発現によって、ZZ始原生殖巣に、本来発現が認められないCyp19 、Foxl2の発現がZW始原生殖巣と同程度に認めらました（論文投稿中）。以上の結果から、DM-Wは卵巣決定因子として、Cyp19 、Foxl2の遺伝子発現を誘導し、卵巣形成を導く事が予想されました。

考察
（1）アフリカツメガエルのZZ/ZW型性決定モデル

図4：アフリカツメガエルにおけるZZ/ZW型性決定の分子モデル（仮説）

本領域研究におけるDM-Wの解析によって、アフリカツメガエルの性決定の最上位遺伝子の実体が明らかになってきたと考えられます。残された課題の1つは、前述したようにDMRT1/DM-Wを頂点とする性決定モデル（図4）を分子・個体レベルでの検証する事です。DM-WおよびDMRT1の始原生殖巣での標的遺伝子が発見できれば、この問題だけでなく、更に、性決定・性分化遺伝子発現ヒエラルキーの理解へ大きな一歩を踏み出す事になると期待されます。

（2） DM-W遺伝子の分子進化

我々は、DM-W遺伝子が進化的に保存されているか、様々な方法で検討を行ってきましたが、現在までのところ、アフリカツメガエル近縁種でそのオルソログの存在は見つかっていません。アフリカツメガエルは、2倍体のツメガエル種からゲノム倍数化後、偽4倍体となり、その後、種分化してきた種の1つと考えられています。このことから、DM-Wは、アフリカツメガエル、あるいは非常に近縁な偽4倍体の先祖種で新しく性（♀）決定遺伝子として分子進化した可能性が考えられます。更に、アフリカツメガエル、2倍体のネッタイツメガエル、ZZ/ZW型のツチガエルの性分化関連遺伝子の染色体分析 ^３）から、アフリカツメガエルのW染色体は、DM-Wと共進化してきた、或はDM-Wが座位した染色体がW染色体となった可能性が考えられます。DM-Wがツメガエル属のすべての共通の性（♀）決定遺伝子で無いであろうという見解は、魚類の性決定遺伝子DMYが一部のメダカ属でしか存在しない事と、種分化という観点から共通性があると考えられます。しかも、興味深い事は、DMYとDM-Wは共に、DMRT1遺伝子の重複進化によって生じた性決定遺伝子であるということです。

（3） 脊椎動物における性決定遺伝子進化および性決定システム進化

　 今後、脊椎動物の性決定機構に関して、システムの共通性と種の多様性という観点から、系統学的に研究、考察する事が望まれます。変温動物の性決定様式には、環境依存型と、性染色体依存型（XX/XY型、ZZ/ZW型など）とが認められますが、DMRT1パラログのDM-Wの発見によって、少なくともDMYを持つXX/XY型のメダカとDM-Wを持つZZ/ZW型のアフリカツメガエルとは、性決定様式は逆でありますが、その性決定直後の卵巣・精巣形成システムにおける遺伝子発現ヒエラルキーに共通性がある事は間違いないと考えられます。環境による影響を被りやすい変温動物の進化過程においては、性決定遺伝子は、性決定システムの最上位遺伝子として、雌雄2つの方向に分岐させる役割を担えばよいので、卵巣あるいは精巣形成の鍵遺伝子、あるいはその遺伝子を制御する遺伝子の上位の遺伝子であれば進化的保存性を保つ必要はなく、種によって多様化したと考える事ができます。これらの動物で鍵となるのは、性ホルモン合成酵素の遺伝子と推測されます。一方、哺乳類の性決定遺伝子は、多くの種の真獣類でSRYであると考えられています。哺乳類は、単孔類から有袋類を経て真獣類/有胎盤類への進化の過程で、性決定システムの脱構築・再構築が行われ（言い換えると、脱・再構築が行われた種系統が生き残り）、性染色体との共進化が行われたため、SRYが性（♂）決定遺伝子として系統進化上、固定されてきたのではないかと、考えられます。今後、環境依存型性決定様式を採用するさまざまな種および恒温動物である鳥類各種の性決定遺伝子の単離と、その性決定機構の解析によって、性決定システム進化の理解が更に深まってくるものと期待されます。

1)Yoshimoto, S., Okada, E., Umemoto, H., Tamura, K., Uno, Y., Nishikida-Umehara, C., Matsuda, Y., Takamatsu, N., Shiba, T., Ito, M. A W-linked DM-domain gene, DM-W, participates in primary ovary development in Xenopus laevis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 2469-2474 (2008).
2) Yoshimoto, S., Okada, E., Oishi, T., Numagami, R., Umemoto, H., Tamura, K., Kanda, H., Shiba, T., Takamatsu, N., and Ito, M. Expression and promoter analysis of Xenopus DMRT1 and functional characterization of the transactivation property of its protein. Dev. Growth Differ. 48, 597-603 (2006).
3) Uno, Y., Nishida, C., Yoshimoto, S., Ito, M., Oshima, Y., Yokoyama, S., Nakamura, M., Matsuda, Y. Diversity in the origins of sex chromosomes in anurans inferred from comparative mapping of sexual differentiation genes for three species of the Raninae and Xenopodinae. Chromosome Res. 16, 999-1011 (2008).