概要

私たちは外界からの多様な情報を感覚器官で受け取り、その情報を脳に伝達し処理することにより行動へとつなげることができます。この情報伝達を担う神経細胞は、情報を受け取る樹状突起と情報を次の神経細胞へ伝達する軸索を持っています。適切な情報処理を行うためには、樹状突起と軸索が適切な接続相手とのみシナプスを形成することが重要です。しかし、私たちの脳は生まれながらにしてこのような精緻な神経回路を持っているわけではありません。発達期には、神経細胞は一旦過剰なシナプスを形成するため、個々の神経細胞は雑多な入力を受けることになります。その後、一度作られた神経回路を「再編成」することで、個々の神経細胞は特定の感覚入力（受容野という）だけを受けることができるようになります。

神経回路の再編成の過程においては、必要なシナプスを強化するだけでなく、不必要なシナプスを刈り込み、ノイズを除去することが重要です。古くから、この過程にはシナプス入力と神経活動（いわゆる神経細胞の「発火」）が重要な役割を果たすことがよく知られてきました。シナプスを強化する仕組みについてはすでによく研究されており、1949 年にドナルド・ヘブが提唱したヘブ則（※１）に基づいて説明されています。これは、シナプス入力と同時に神経細胞が活動（発火）すると、そのシナプスが強化されるという法則で、メカニズムの詳細もよく分かっています。逆に、入力が弱く、神経細胞が同時に活動しない場合にはそのシナプスは除去されますが、その仕組みについてはよくわかっていませんでした。異なる入力を受けるシナプスの間で競合が起こり、強くて必要なシナプスのみが「勝者」として残る一方、それ以外が「敗者」として刈り込まれるという「シナプス競合」という現象があると提唱されてきましたが、どのようなメカニズムによってシナプス間の競合が起こるのかについては、数 10年来の大きな謎でした。

この謎に挑むため、本研究ではマウス嗅球の僧帽細胞に着目しました。僧帽細胞は、発達過程の初期には複数の樹状突起を複数の「糸球体」という構造に伸ばしており、複数の嗅覚受容体（匂いセンサー）からの情報が混線したまま入力されます。しかしながら、僧帽細胞はやがて樹状突起の刈り込みを行い、最終的には 1 本の樹状突起のみを 1 つの糸球体にのみ接続し、そこで１種類の嗅覚受容体の情報のみを受け取るようになります（受容野が精緻になる）。この刈り込みの結果と、僧帽細胞では匂い情報が混線することなく識別できるようになるのです（図２）。研究グループはこの僧帽細胞の樹状突起刈り込みをモデルとして、シナプス競合のメカニズムを調べました。

まず、僧帽細胞の樹状突起刈り込みにも神経活動が必要かどうか調べるため、子宮内電気穿孔法（※ ２）を用いて僧帽細胞に Kir2.1（※３）を過剰発現させ、僧帽細胞の神経活動を人為的に抑制しました。 その結果、樹状突起が刈り込まれなくなることが判明しました（図３）。次に、樹状突起の刈り込みに 必要なシナプス入力がどこからやってくるのかを調べました。これまでの研究では、少なくとも鼻腔か ら脳の嗅球へと情報を伝達する嗅神経細胞からの入力は僧帽細胞の樹状突起刈り込みに必要ないこと が示されていました。そこで、嗅神経細胞からではなく、嗅球内の自発的な神経活動に基づく入力が関 わっている可能性を検討しました。僧帽細胞に GCaMP（カルシウムセンサー）を発現する遺伝子改変 マウスを用いてカルシウムイメージング（※４）を行うと、新生仔期には僧帽細胞の自発的な神経活動 が観察されました。さらに、単離した嗅球においても同様の自発神経活動が観察されたことから、この 活動は、嗅球内で生み出されていることがわかりました。この単離した嗅球のサンプルに対して薬剤の 効果を調べる実験を行ったところ、自発神経活動にはグルタミン酸が関わっていることがわかりました。 また、僧帽・房飾細胞に破傷風毒素軽鎖（※５）を発現する遺伝子改変マウスを用いて僧帽・房飾細胞 からのグルタミン酸の放出を遮断しました。すると、自発神経活動は減少し、樹状突起の刈り込みも阻 害されました。以上のことから、僧帽・房飾細胞どうしがグルタミン酸を放出し合うことで、自発的な 神経活動が生じ、刈り込みが起こっていることが明らかとなりました（図４）。

次に、シナプスにおけるグルタミン酸の入力がどのようにして樹状突起の刈り込みを引き起こすのか を検討しました。グルタミン酸を受け取る NMDA 受容体の役割について調べるため、NMDA 受容体の 必須サブユニットである GluN1 を僧帽細胞特異的に欠損させたところ、樹状突起の刈り込みが阻害され ました。そこで、NMDA 受容体の下流で刈り込みを制御する分子群の探索を行いました。神経突起の退 縮に関わる Rho サブファミリー遺伝子群（RhoA, RhoB, RhoC）（※６）を CRISPR-Cas9（※７）法を 用いて全て欠損させると樹状突起の刈り込みが阻害されることを見出しました。また GluN1 を欠損した 僧帽細胞に RhoA を過剰発現させると刈り込み異常が正常に戻りました。これらの結果から、NMDA 受 容体を介して、刈り込み分子である RhoA を活性化させることが樹状突起の刈り込みにつながることが 明らかとなりました（図５）。

しかし、1 本の樹状突起のみを「勝者」として残し、それ以外の樹状突起を刈り込むためには RhoA の活性化は「敗者」となるべき樹状突起でのみ起こる必要があります。その仕組みを明らかにするため、 RhoA のセンサーを用いた FRET イメージング（※８）を行い、NMDA 受容体が活性化された際の RhoA 活性の時空間パターンの解析を行いました。嗅球スライスを NMDA 受容体だけ選択的に活性化できる 薬剤 NMDA（※９）で刺激すると、僧帽細胞の多くの部分では RhoA の活性上昇が見られましたが、シ ナプスが最も豊富な樹状突起の先端では逆に RhoA 活性が低下することが判明しました。一方、高濃度 カリウム溶液を用いて、僧帽細胞全体を脱分極（※１０）させた場合には、樹状突起の先端部を含む僧 帽細胞全体で RhoA が活性化しました。これらの結果から、NMDA 受容体が活性化されると、その近傍 では局所的に RhoA の活性を抑制されるが、引き続いて神経細胞が脱分極すると、神経細胞全体で RhoA が活性化され、保護されていない「敗者」の樹状突起の刈り込みが促進される、という可能性が考えら れました（図６）。

この可能性をより直接的に証明するために、複数ある樹状突起の 1 つで NMDA 受容体を活性化した 際にそれ以外の樹状突起で RhoA の活性がどのように変化するのかを FRET イメージングによって検討 しました。まず、枝分かれが多くてシナプスが豊富な樹状突起とシナプスが少ししかない樹状突起の両 者を持つ僧帽細胞のみに着目して解析を行いました。このタイプの僧帽細胞では、NMDA 刺激を行うこ とで、シナプスが豊富な樹状突起の NMDA 受容体を選択的に活性化することが可能です。これらの細 胞に対して NMDA 刺激を行うと、RhoA の活性はシナプスの豊富な樹状突起で低下する一方、それ以外 の樹状突起では上昇することが観察されました（図 7A）。対照的に、シナプスの豊富な樹状突起を 2 本 持つ僧帽細胞において同様の実験を行うと、どちらの樹状突起においても RhoA の活性低下が見られま した（図 7B）。これらの結果から、RhoA の活性制御の役割について、以下のようなことが考えられま す。樹状突起において強いグルタミン酸入力が入ると、NMDA 受容体が活性化され、RhoA が局所的に 抑制されることで刈り込みに対する保護機構が働きます。一方、引き続いて生じる脱分極によって、僧 帽細胞全体で RhoA が活性化され、保護されていない樹状突起の刈り込みが促進されます。このように、 RhoA はシナプス入力を直接受けたシナプス「以外」を刈り込む「側方抑制シグナル」として作用して いると考えられます。従って、複数の樹状突起間でシナプス入力の程度に違いがあると、お互いを抑制 し合う結果、強い者はますます強く、弱い者はますます弱くなり、最終的に 1 本の樹状突起のみが「勝 者」として残ることになると考えられます（図８）。

最後に、この RhoA を介した側方抑制の仕組みが僧帽細胞以外の神経細胞の樹状突起再編成にも関与 しているのかを検討しました。マウス大脳皮質の感覚野にはヒゲ 1 本 1 本の触覚情報に特化したバレル と呼ばれる構造が存在します。そこに存在する 4 層ニューロンは、はじめは雑多な入力を受けています が、発達期の樹状突起刈り込みを経て、1 本のヒゲからの触覚情報のみを受け取るようになります。こ れまでに GluN1 を欠損させると刈り込みが起こらなくなり、1 本のヒゲ以外の触覚入力が混線すること が知られていました。本研究では、この 4 層ニューロンにおいて Rho サブファミリー遺伝子群を欠損さ せると、僧帽細胞と同様に樹状突起の刈り込みが起こらなくなることが判明しました。NMDA 受容体と RhoA シグナルが働かないと、樹状突起間の側方抑制シグナルを生じることができないため、特定のヒ ゲの入力以外の入力を受ける樹状突起も残ったままになってしまうと考えられます（図９）。

本研究により、NMDA 受容体と RhoA シグナルに基づくシナプス・神経突起の「局所的な保護」と「側方抑制」の仕組みがシナプス競合の分子実体であることが明らかとなりました。これまで、正しい回路が「作られる」仕組みは多く研究されてきましたが、不要な回路の「刈り込み」の原理は長年の謎でした。発達期のシナプス再編成は脳のいたるところで起こっており、本研究で明らかとなったRhoA を介したシナプス競合と神経突起の刈り込み機構は、神経回路再編成における普遍的な原理であると考えられます。また、ヒトにおいてはシナプスの刈り込みが適切に行われないことが、神経疾患の原因となることが示唆されており、そうした疾患の発症メカニズムの理解にも貢献することが期待されます。

本研究は JST さきがけ「脳神経回路の形成・動作と制御」、CREST「多細胞間での時空間的相互作用の理解を目指した定量的解析基盤の創出」、日本医療研究開発機構(AMED)「革新的技術による脳機能ネットワークの全容解明プロジェクト」「脳とこころの研究推進プログラム（領域横断的かつ萌芽的脳研究プロジェクト）」、科学研究費補助金、新学術領域研究「スクラップ＆ビルドによる脳機能の動的制御」「マルチスケール精神病態の構成的理解」、学術変革領域「脳の若返りによる生涯可塑性誘導-Plasticity臨界期機構の解明と操作」、三菱財団、住友財団、中島記念国際交流財団、持田記念医学薬学振興財団、上原記念生命科学財団の助成によって行われました。本成果は、令和 5 年 6 月 7 日(水) (米国時間午前11 時)に米国の科学雑誌『Developmental Cell』に掲載される予定です。本研究は千葉大学、関西医科大学との共同研究として、九州大学および理化学研究所多細胞システム形成研究センター（研究当時）にて実施されました。